HIC(hydrophobic interaction chromatography)와 TAP(tandem affinity chromatography)

소개글

안녕하세요 현재 생명공학과에 재학중인 학생입니다
생명공학 연구방법론이란 교과목에대한 과제를 한 것입니다
HIC(hydrophobic interaction chromatography)와 TAP(tandem affinity chromatography) 에 대해 조사한 것입니다.
특히 뒤에 있는 TAP 방법은 이방법을 사용한 논문을 바탕으로
그 실험목적, 방법, 결과를 정리해 놓았습니다~

목차

1. chromatography를 적용하여 ‘초록이’ 단백질을 대장균 extract에서 분리하였다. 다음은 이 때 적용한 chromatography에서 사용한 buffer이다. 사용한 buffer를 기반으로 어떤 chromatography를 적용하였는지 유추하시오. 그렇다면 이 chromatography는 ‘초록이’단백질의 어떤 특징을 이용하였겠는가?
2. `tandem affinity purification(TAP)`에 대하여 조사하고 이 방법을 적용한 논문을 선택하여 이 방법을 적용한 목적, 실행한 실험방법, 그리고 결과를 요약하시오.
- TAP 방법을 적용한 논문 -

본문내용

Equilibration Buffer-A high salt buffer (2M (NH)SO)
Binding Buffer-A very high salt buffer (4M (NH)SO)
Wash Buffer-A medium salt buffer (1.3M (NH)SO)
Elution Buffer-A very low salt buffer (10mM Tris/EDTA)


염도가 상대적으로 높지 않은 Equilibration buffer를 사용해서 ‘초록이’단백질이 소수성 결합을 하는 column에 붙을 수 있는 평형 상태를 유지시켜주는 것이다. 결정적으로 ‘초록이’단백질이 column 속에 붙을 수 있는 것은 염도가 높은 buffer에서 단백질의 삼차구조가 바뀌면서 단백질이 갖는 소수성 부위를 더...


TAP 기술은 단백질-단백질 사이의 상호관계(interaction)를 조사할 때 사용된다. 이 기술을 통해서 원하는 조각으로 융합단백질을 만들고 TAP-tag를 마지막 부위에 붙이는 것이 가능하다. TAP-tag 방법은 Saccharomyces cerevisiae라는 미생물로부터 얻은 한 복합체를 이용하여 높은 순도로 순수한 단백질 복합체를 분리해 내고자 할 때 사용된다. TAP-tag는 두 개의 높은 친화성을 같은 염기서열, 단백질 A, calmodulin결합서열(calmodulin binding peptide(CBP)을 포함하고, 이 TAP-tag는 TEV-protease에 대한 특이성이 높은 절단부위에 의해 나뉘어진다. 또한 TAP-tag는 선택된 단백질의 N 혹은 C 말단에 첨가되어 지게 된다. 세포가 자라고 용해되면, TAP-tagged 단백질과 주변 단백질들은 강하게 친화적으로 IgG 항체가 붙어있는 유리구슬에 결합하게 된다. 이후 TEV-protease를 처리해주면 복합체가 방출되고, 방출된 복합체는 Calmodulin이 붙어 있는 유리구슬에 결합하게 된다. 이렇게 결합되어 있는 복합체는 EGTA를 처리해 줌으로써 용리되게 된다.

참고 자료

Bernd Schimanski, Tu N. Nguyen, and Arthur Gunzl. 2005. Highly Efficient Tandem Affinity Purification of Trypanosome Protein Complexes Based on a Novel Epitope Combination. Eukaryotic Cell, Now. 2005, p. 1942-1950