[생화학 실험보고서] E. coli system을 이용하여 Taq polymerase를 Overexpression시킨 후 정제

소개글

Taq polymerase를 E. coli system을 이용하여 Overexpression시킨 후 정제하는 실험입니다.

목차

1. 목적

2. 원리

3. 시약 및 기자재

4. 실험방법

5. 실험결과

6. 고찰

7. 참고문헌

본문내용

1. 목적
Taq polymerase를 E. coli system을 이용하여 Overexpression시킨 후 정제한다.


2. 원리
1) Taq polymerase
- Thermus aquaticus에서 얻어진 94 kDa size의 protein
- 74 ℃에서 DNA를 복제할 수 있는 thermostable enzyme이며 95 ℃에서 40분의 half-life를 갖음.
- Mg가 존재할 때 5‘ -> 3’방향으로 nucleotide를 duplex DNA에 polymerization하는 반응을 촉매함.
- 5‘ -> 3’방향으로는 exonuclease activity를 갖으나 3‘ -> 5’방향으로는 activity를 갖지 않음. Proof-reading이 되지 않으므로 error가 존재.

<중략>

packing된 후에 10 bed volume의 buffer C로 equilibration한다.
10) Sample loading
; Sample을 equilibrated Biorex 70 resin column에 loading한다.
* Flow through 25 ㎕ (1/120)를 보관한다. -> F.T.
11) Column washing
; Sample을 loading한 resin을 900 ㎕ buffer C와 50 mM KCl로 washing한다.
* 300 ㎕씩 두 번 washing, 마지막 300 ㎕ washing에서 25 ㎕ (~1/12)를 보관한다. -> Washing

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6. 고찰
* 아래에 쓰인 고찰은 intensity 확인이 정확하게 이루어졌다는 것을 가정 하에 적은 것임.
1) E. coli system을 이용하여 overexpression시킨 Taq polymerase를 분리 정제하는 실험이었다. 예상했던 바와 같이 수득률이 적게 나타났다. 이제부터 각 step에 대하여 분석하여 보겠다.

참고 자료

생화학실험(2) 실험교본, 교육과학기술부의생명특성화사업단.
Jeremy M. Berg, John L. Tymoczko, Lubert Stryer. 2007, Biochemistry, sixth ed.
http://en.wikipedia.org/wiki/