[진단 분자 유전학 REPORT] chapter Ⅵ - RT - PCR

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목차

1. Introduction

2. RT-PCR (The basic Method)
2.1 Isolating and Working with RNA
2.2 Storage of Purified RNA sample

3. Synthesis of cDNA
3.1 overview
3.2 Reverse Transcriptase
3.3 Priming first-strand cDNA Synthesis

4. Amplification of cDNA by PCR
4.1 PCR Primer Design
4.2 PCR Cycle Parameters

5. Visualization and Verification of PCR Product

6. Consideration for Quantitive RT-PCR

7. DNA Template Contamination ; Problem and Concerns

8. Positive and Negative Controls in RT-PCR

9. Specialized Application of RT-PCR
9.1 RT-PCR Application in the Quantitation of specific mRNA Targets
9.2 RACE
9.3 Differential Display RT-PCR ; RNA Fingerprint Analysis

Reference

본문내용

1. Introduction
RNA level을 측정할 수 있는 능력은 유전자 발현 연구에 핵심적인 역할을 해왔다.
Northern blot, dot/slot blot, nuclease protection assay 는 전통적으로 mRNA 발현 분석에 사용되었던 방법이었으나, 민감도가 떨어지고, 많은 양의 RNA를 요구하기 때문에 비효율적이었다. 그에 비해 적은 transcript와 한정된 양의 물질로도 작업이 가능한 RT-PCR은 혁신적인 변환이었다. 적은 양의 RNA롤 역전사하는 RT의 능력과 PCR의 DNA를 증폭시키는 힘이 짝을 이룬 방법이다.

◎ mRNA와 DNA를 template로 쓰는 것의 차이
mRNA는 같은 genomic DNA에서 유래하였다고 해도 splicing방법에 의해 변화된 것도 찾을 수 있다. 또한 각 조직마다의 expression정도를 찾기에도 이용되며, 무 엇 보다 coding sequence만 연결된 구조를 원할 때 쓰인다. 돌연변이를 찾고자 할 때는 굳이 RNA를 template롤 할 필요는 없다. 왜냐하면 돌연변이는 거의 DNA의 변화에서 오기 때문이다.

◎ RT-PCR 의 장점 ; ① 다방면에 활용, 민감도가 높다.
② 동시에 여러 sample 비교 가능.
③ 빠른 전환 시간

◎ RT-PCR 의 단점: PCR 과정 중 기하급수적 증폭이 일어나기 때문에 PCR 효율의 아주 작은 차이도 최종적인 결과에 큰 영향을 미칠 수 있다.

◎ RT-PCR 의 4 step ; ① RNA isolation
② Reverse transcription
③ PCR Amplification
④ Product analysis

2. RT-PCR (The basic Method)
2.1 Isolating and Working with RNA
☞ RNA 분리의 원칙
* RNase로부터 RNA를 보호 한다
* 단백질을 제거 한다 --> phenol/chloroform 또는 ultra-CF.

참고 자료

Molecular Diagnostics humana press William B. Coleman & Gregory J. Tsongalis chapter 6.
Molecular cloning Cold Spring Harbor Laboratory Press Joseph Sambrook, David W.russell 8-19,47,55,97,110
http://biochemistry.yonsei.ac.kr/biochem_molecular/
http://www.kjcp.co.kr
http://www.bohan.co.kr