[실험프로토콜] western blot - SDS-PAGE gel & transfer & antibody

소개글

western blot을 하는 방법을 설명한 것입니다.
protein을 SDS-PAGE gel을 이용하여 내린 후 transfer과정을 거쳐 antibody를 걸치는 것까지를 그림으로 자세히 표현했습니다.
transfer기기는 두가지 종류로 RIO-RAD과 Invatrogen로 기기 둘다 설명해두었습니다.
직접 해본 결과를 토대로 그림을 그려 표현했기에 처음하는 분들도 무리없이 따라하실수 있을거라 예상됩니다.

목차

1. Method

2. Transfer
1) Method 1. [Invitrogen transfer / iBotTM]
2) Method 2. [Bio-RAD / Trans-Blot SD]

3. Next day

4. Using Materials (machine & accessory)

본문내용

Method
First day
1. SDS-PAGE gel을 tank에 연결.
- gel 수가 홀 수 인 경우에는 빈 plate를 끼워줌.
2. 1X running buffer로 tank내부를 채우고 외부도 gel 개수에 따라 채움.
- 외부는 처음부터 가득 채우지 말고 band가 어느 정도 내려가는 것을 확인한 후 채움.
3. protein marker (Tris-glycine 4-20%) 2.5ul loading.
4. sample loading.
- Total loading volume 20ul = protein sample + auto D.W. + 5X sample buffer 4ul
- 빈 well이 생길 경우 sample buffer를 loading하여 균형을 맞춰줌.
5. gel running.
1) 기기를 켜고 전극에 맞게 선을 연결한 다음 전압을 설정.
- 80-100V → (Max.) 120V, 5-10mA → (Max.) 15mA로 running.
- 80V에서 marker가 펴지는 것같으면 100V으로 change.
2) 원하는 band가 나올 때까지 running.
- marker을 보고 판단.
6. Transfer (Method1-2)
[Method 1]
1) bottom(with membrane) → gel (→ 3M paper) → top 순서로 setting.-
Bottom에 membrane이 포함.
- gel에서 membrane으로 이동할 수 있도록 gel은 Bottom쪽으로 올림.
2) bottom이 마르지 않도록 D.W.를 뿌리고 gel을 올림.
- membrane위 3M paper를 올릴 경우 D.W.를 뿌리고 밀대로 살짝 밀어줌.
3) 기기에 위의 순서로 setting한 것을 올림.
4) 기기에 스펀지를 올림.
5) 기기의 전원 on.
6) 기기에 붉은 불이 들어오면 start.
- setting은 7min.
7) 소리가 나면 stop.
8) 기기를 off.

참고 자료

없음