Site-directed Mutagenesis & DNA sequencing

목차

1. Introduction

2. Method and materials
1) mutagenic PCR
2) DpnⅠ digestion
3) Transformation
4) Visualization

3. Data and results

4. Discussion

본문내용

Abstract
이번 실험은 site-directed mutagenesis의 방법 중 하나인 whole plasmid mutagenesis를 통하여 특정한 plasmid의 DNA에 돌연변이를 유도하여 이를 관찰하는 실험이었다. whole plasmid mutagenesis의 첫 번째 과정인 mutagenic PCR을 하면 mutation된 plasmid와 mutation되지 않은 original template DNA가 존재하게 되는데, 이러한 original template DNA는 두 번째 과정인 DpnⅠ digestion으로 제거할 수 있다. 사용한 plasmid으로는 크기가 3337bp이고 ampicillin resistant gene을 포함하여 원하는 mutation된 plasmid만을 선택하게 해주며, UV에 자극받게 되면 많은 형광 빛을 내는 GFP variant가 있는 pGFPuv를 사용하였다. GFP는 26.9kDa이며, 총 238개의 아미노산으로 이루어져 있고 11개의 beta-sheet 구조가 beta barrel을 이루고 있다. 실험은 Y66H mutation을 한 것, Y66H/Y145F로 mutation 시킨 것 그리고 wild type을 구하여 UV를 통해 관찰하였다. 결과인 [Fig 6.]를 보면 가장 왼쪽 wild type은 정상적인 녹색의 형광이 빛나는 것을 확인할 수 있고, 중간의 colony는 Y66H mutation시킨 것으로 파란색의 형광이 빛나는 것을 볼 수 있으며, 마지막으로 가장 오른쪽은 Y66H/Y145F mutation은 중간의 Y66H mutation시킨 것보다 더 밝게 빛나는 것을 볼 수 있다. 또한 Y66H mutation시킨 것의 colony가 가장 많은 것을 확인할 수 있다.

Introduction
이번 실험은 site-directed mutagenesis를 통해서 특정한 plasmid의 DNA에 돌연변이를 유도하여 이를 관찰하는 실험이었다. 우선 GFP(green fluorescent protein)는 자포동물의 해파리인 Aequorea Victoria에서 발견되었으며 녹색의 형광을 발하는 단백질이다.

참고 자료

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