[A+] 서강대 현대생물학실험1 6x His tagged eGFP

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실험제목: 6x His tagged eGFP의 발현과 정제 및 정량과 정성적 특징 확인

실험 초록
: 원하는 단백질을 특정 system으로부터 얻어내는 데에 있어서, 단백질의 과발현과 정제, 정량과 정성적 특징의 확인은 필수적이다. 본 실험에서는 eGFP를 얻어내기 위하여, 6x His-tagged eGFP가 insert된 pET28a(+)를 BL21(DE3) E.coli에 transformation하여 IPTG를 처리해 6x His-tagged eGFP를 과발현시켰으며, sonication을 이용하여 cell disruption하였다. 정제과정으로는 6x His-tag와 특이적으로 결합하는 Ni2+-NTA resin으로 IMAC를 수행하고 MWCO 10kDa의 Amicon centrifugal filter tube로 ultrafiltration 하였다. SDS-PAGE를 이용해 정제된 단백질의 molecular weight을 구했으며, 28 kDa정도로 나타나 문헌값인 26.9 kDa보다는 크게 얻어졌다. 이는 6x His-tag와 SDS의 결합 때문으로 보인다. Extinction coefficient assay(A280 nm, A488 nm)와 Lowry assay를 이용하여 정제된 sample의 단백질을 정량하였으며, 순서대로 0.90 mg/ml, 0.605 mg/ml, 1.90 mg/ml로 구해졌다. A280 nm로부터 얻어진 질량농도는 sample 내의 eGFP를 포함한 다른 단백질과 핵산에 의한 값이며, A488 nm로부터 얻어진 질량농도는 sample 내 eGFP를 잘 대변하는 값이다. Lowry assay로부터 얻어진 질량농도는 BSA를 standard로 한 값으로, BSA를 구성하는 Tyr, Trp, Cys의 수가 eGFP의 것보다 2배 이상 많아서 실제 eGFP의 농도보다 큰 값이 얻어졌다. 또한, buffer에 포함된 Tris에 의해서도 미약하지만 영향을 받았다.

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