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소개글
DNA 추출 방법 및 전기영동의 원리 및 종류에 대해 조사한 예비 리포트 입니다.목차
1. PORPOSE2. BACKGROUND UNDERSTANDING
본문내용
우선 DNA isolation할 대상 cell을 충분히 모은다. 세균같은 경우 원심분리기를 사용하여 원심분리하여 세균 침전물을 모으는 것이 부피를 줄이기에 적합하다.DNA는 핵에 국한되어 존재함으로 핵을 조직 또는 세포로부터 분리한다. 세포로부터 세포 소기관을 분리하는 방법은 다양하다.
1)Homogenization(Fig.2)
세포를 물리적인 마찰력을 이용해서 깨뜨려 소기관을 분리하는 방법이다. vessel에 cell나 cell이 모여있는 tissue를 넣은 후 plunger를 이용하여 왕복운동을 해주면 마찰력에 의해 cell이 깨진다.
2)Ultrasonic vibration
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이렇게 DNase를 포함하고 있는 lysosome을 제거할 수 있지만 lysosome이 분리과정 중 터지거나 핵내에 있는 DNase를 inactivation시키기 위해 DNase 기능에 필수적인 Mg2+를 제거할 수 있는 EDTA를 함유하고 있는 용액을 넣어 실험을 진행하며 핵을 부순다. 그리고 SDS를 사용해 DNA에 결합해 있는 단백질을 해리시킨다.
세포를 용해한 다음 부분적으로 용해된 세포벽 같은 불용성(insoluble) 세포 잔사물(cell debris)은 원심 분리하여 제거함으로써 세포 내용물로 이루어진 supernatant를 추출한다.
추출된 supernatant가 포함하고 있는 여러 성분 중에서 DNA 만을 정제하기 위해서는 우선 프로네이즈(pronase)나 단백질 분해 효소 K (proteinase K)를 이용하여 세포 추출물을 처리하여 펩타이드 중합체(polypeptides)를 절단해서 작은 단위로 만든 다음, 유기 용매(organic solvent)인 페놀(phenol) 또는 페놀과 클로로포름(chloroform)을 1:1로 혼합한 용액을 가하여 원심 분리한다. 이를 이용하면 DNA와 RNA와 같은 비교적 분자량이 적은 물질은 supernatant에 포함되고, 기타 단백질은 결집하여 중간층을 이루며 페놀은 침전된다 한편 RNA 분자를 제거하려면 리보핵산 분해 효소(riibonuclease)를 사용하여 완전 분해 시킨다.
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전기영동(electrophoresis)
전기영동이란 molecule의 charge와 mass의 비율을 기초로 분리하는 방법이다. 많은 DNA 연구에서 gel electrophoresis가 사용되는데 이 electrophoresis는 DNA뿐만 아니라 RNA, Protein 등의 molecule이 가지고 있는 charge의 특성이나 mass, pH등을 가지고 이들을 분류해 내는 방법으로 아주 유용하게 쓰인다.
1)gel electrophoresis
gel electrophoresis는 DNA 연구에 많이 사용되는 것으로 gel은 colloid가 굳어진 상태를 말한다. 이렇게 굳어진 gel은 특정한 망 배열로 굳어져 전하에 따른 molecule의 움직임을 방해하는데 이렇게 하여 단백질이나 핵산과 같은 거대 분자를 크기나 전기적 전하에 의해 물리적으로 분리하는 방법이다.
실험방법은 납작한 직사각형 모양의 gel 한 끝에 DNA가 들어가는 홈을 만들고 그 안에 각 시료를 넣는다. 이어 DNA 시료를 넣어준 부분의 gel에 음극을 연결하고 반대편 끝에 양극을 연결한 후 전류를 걸어주면, DNA의 phosphate group 때문에 전기적으로 음성을 나타내므로 양극으로 이동한다. DNA가 이동함에 따라 gel을 구성하고 있던 것(일반적으로 agarose)의 복잡한 망구조로 인해 길이가 긴 DNA 조각이 작은 조각보다 천천히 이동하므로 DNA가 길이에 따라 분리된다.
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참고 자료
-1. 생명과학(5th), 이창희역, 바이오사이언스, 2006; p227~281-2. (Lehninger) Principles of biochemistry(4th), David L. Nelson, Freeman, 2005, p92~94
등등...
